熒光定量pcr技術原理及步驟

　　熒光定量PCR技術是一種在PCR擴增反應體系中加入熒光基團，通過實時監測每一個循環產物的熒光信號，從而實現對起始模板的定量及定性分析的技術。熒光定量PCR的原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，這些熒光基團會隨著PCR反應的進行而釋放出熒光信號。通過實時監測這些熒光信號的強度變化，可以反映出PCR反應的進程和結果。具體來說，在PCR反應的指數期，模板的Ct值（即達到設定閾值時的循環數）和該模板的起始拷貝數存在線性關系，因此可以通過已知起始拷貝數的標準品作出標準曲線，再根據樣品的Ct值在該曲線上確定其所含起始模板的數量。

　　

　　1、設計并合成引物：這是目標基因引物的設計和合成，確保其特異性和有效性。引物是PCR擴增的關鍵，它們決定了PCR反應能否成功擴增出目標基因。

　　

　　2、準備反應體系：將引物、模板DNA、熒光標記的探針或染料以及其他必要的反應成分混合在一起，形成PCR反應體系。其中，熒光標記的探針或染料用于后續的熒光檢測。

　　

　　3、進行PCR反應：將反應體系置于PCR儀中，按照設定的程序進行PCR擴增。在擴增過程中，熒光信號會隨著PCR產物的增加而逐漸增強。

　　

　　4、實時檢測和定量：在PCR反應進行的同時，實時監測每個循環結束時的熒光強度。當檢測到的熒光信號超過設定的閾值時，記錄此時的循環數（Ct值）。Ct值與起始模板的量成反比，即起始模板量越多，Ct值越小。

　　

　　5、數據分析：根據Ct值和標準曲線計算出樣品中目標基因的起始拷貝數或相對表達量。這一步驟通常由專門的軟件完成。

　　

　　熒光定量PCR技術以其高靈敏度、高特異性以及能夠實現實時定量的特點，在生物醫學研究、疾病診斷、藥物研發等領域發揮著重要作用。