編譯：微科盟道友留步，編輯：微科盟木木夕、江舜堯。
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導讀
活性污泥法在水處理中的廣泛應用產生了大量的剩余污泥（Waste Activated Sludge，WAS）。剩余污泥中含有大量易腐有機質，如果處理不當，極有可能造成嚴重的二次污染。通過厭氧消化法處理剩余污泥，既能夠削減其造成的污染、降低碳排放，同時能夠以甲烷的形式回收生物能源。但是，由于剩余污泥體系復雜且功能微生物群豐度較低，在一定程度上阻礙了其厭氧產甲烷效率，限制了剩余污泥的資源化利用潛力。基于此，研究者開發出了許多手段對剩余污泥進行預處理，以提升厭氧產甲烷效率。本研究通過污泥界面熱力學、電子傳遞和微生物群落的研究，揭示了等電點(pI)預處理對甲烷產率的增強作用。實驗結果表明，經pI預處理后，產甲烷潛力、最大產甲烷速率和沼氣中最大甲烷占比分別提高了122.2%、154.4%和17.4%，表明pI預處理提高了甲烷的產效率。在170天的產甲烷發酵周期內，分析了pI處理前后，污泥固液界面非共價相互作用能、電子轉移能力（ETC）及還原峰電位的變化，結果表明：pI預處理增強了污泥自驅動固液界面疏水性、增加了界面酶反應的非生物驅動力、提高了電子轉移效率，并且降低了還原反應的勢壘。由此推測，這些變化將會導致甲烷產量的增加，界面自由能(IFE)和ETC與甲烷日產量之間的相關性分析證實了這一點。此外，對發酵過程中添加和不添加pI的污泥樣品進行微生物群落分析，結果表明：pI預處理顯著(P < 0.05)提高了與水解、酸化和產甲烷等過程相關的功能微生物的相對豐度。進一步的研究表明，污泥表面的疏水引力和較高的ETC值有利于氫營養型產甲烷菌的富集(+29.9%)。這些發現有望為開發第二代預處理方法提供一個概念框架，并為揭示厭氧消化這一“黑箱”過程的細節提供技術理論參考。
原名：Enhancing methanogenic fermentation of waste activated sludge viaisoelectric-point pretreatment: Insights from interfacial thermodynamics，electron transfer and microbial community
譯名：利用等電點預處理以強化剩余污泥在厭氧條件下產甲烷的過程：界面熱力學、電子轉移及微生物群落
期刊：Water Research
IF：9.13
發表時間：2021.3
通訊作者：戴曉虎
通訊作者單位：同濟大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室；上海市污染控制與生態安全研究院
從位于江蘇蘇州的污水廠收集剩余污泥（WAS）。在實驗室條件下，對剩余污泥進行30天的厭氧培養以獲得用于產甲烷發酵的接種污泥。不同污泥樣品的性質見表S1。pI測量和pI預處理見之前發表的文章以及附錄文本S1和S2。不同pH條件下污泥的Zeta電位見圖S1。經過pI處理的污泥樣本為實驗組（EG），未經pI預處理的污泥樣本為對照組（CG）。 通過為期170天的中溫批次試驗（37℃，120 rpm）研究了污泥的產甲烷發酵。每個污泥樣品使用32個相同的血清瓶（250 mL），每個樣品分為兩組平行研究。每瓶以1:2的VS比投入接種污泥和基質。對EG組，包含156.8 g基質和72.4 g接種污泥；對CG組，包含176.9 g基質和72.4 g接種污泥；此外，以僅包含72.4 g接種污泥瓶子作為空白樣。試驗開始前，調節各瓶子中污泥的pH至7，并密封。試驗期間，定期測量沼氣中的甲烷含量及相應的NCMP值，并取出一定量污泥用于微生物群落分析。使用偽一階和經過修飾的Gompertz動力學模型擬合前25天的甲烷凈累積產量（NCMP）。通過接觸角測量、電化學工作站等分析了污泥固液界面的熱力學和電化學特性。根據前人研究計算了電子轉移能力（ETC）、電子接受能力（EAC）、電子供給能力（EAC）、電導率（σ）、離子強度（μ）。通過高通量測序分析了污泥中細菌和古菌群落。采用標準方法測定了污泥樣品的TS、VS/TS比值和主要多價金屬含量（Al、Ca、Fe、Mg、Zn、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb）。通過Zetasizer測定了污泥的Zeta電位和σ值。通過馬爾文粒徑分析儀分析了污泥的粒徑分布及Df。通過氣相色譜分析了VFA濃度。所有的測試均進行三次，所有的試驗數據以平均值+標準差的形式表示。
收集產甲烷發酵前25天不同的污泥樣品（EG和CG），其NCMP值如圖1所示。NCMP從第0天增加到第20天，20天后無明顯變化（P>0.05）。因此，研究發酵前25天的甲烷生成是合理的。此外，EG中的最大NCMP值為274.4±3.0 mL CH4/g VS，是CG（123.5±2.5 mL CH4/g VS）的兩倍多，表明pI預處理顯著提高了WAS的甲烷產量。如圖1所示，盡管從第0天到第4天，EG和CG之間的NCMP沒有顯著差異，但在第4天之后，EG的NCMP始終高于CG。為了了解這兩組之間的差異，采用偽一階和修正的Gompertz模型擬合來自EG和CG的NCMP數據。前者通常用于描述NCMP數據，前提是水解是速率限制步驟，后者通常用于產甲烷菌的生長速率受某種抑制行為限制時。圖1（a）和（b）分別顯示了基于偽一階模型和修正Gompertz模型的NCMP擬合曲線。表S3和S4（SM）總結了相應的動力學參數。如圖1（a）和（b）所示，偽一階模型（R2=0.9849，P<0.001）和修正的Gompertz模型（R2=0.9976，P<0.001）之間，CG的NCMP擬合系數（R2）沒有顯著差異，表明兩個模型都能準確地描述CG的NCMP數據。兩種模型模擬結果均較好的一個合理解釋是，污泥水解是限速步驟，而產甲烷菌的生長速度也受到CG產甲烷發酵過程中污泥水解不良（抑制行為）的限制。因此，兩種動力學模型都能準確地描述CG的NCMP數據。這一結果也與之前的研究結果一致。然而，對于EG，圖1（a）和（b）表明，修正的Gompertz模型（R2=0.9972，P<0.001）擬合效果優于偽一級模型（R2=0.9376，P<0.001），這表明，在EG產甲烷過程中，產甲烷菌的生長速率是產甲烷反應的速率限制步驟，而不是污泥的水解速率。我們之前的研究結論也與這一結論相符。
圖1 實驗組（EG）和對照組（CG）的甲烷凈累積產量（NCMP）及采用不同的動力學模型的擬合曲線：（a）偽一級模型；（b）修正的Gompertz模型。誤差線為SD。 在先前的研究中，有研究者發現pI預處理顯著增強了污泥的有機溶解、水解和酸化，因此，可以假設在EG產甲烷發酵期間，VFA的代謝率在短時間內（即滯后時間）低于其產生率，導致VFA累積。這種積累，在這段時間內，將反過來抑制產甲烷菌的生長。然而，隨著發酵的繼續，積累的VFA逐漸轉化，導致NCMP顯著增加（圖1）。這一觀點也與發酵期間EG和CG之間VFA濃度的差異一致（圖S2，SM）。此外，由于改進的Gompertz模型適用于描述EG和CG的NCMP數據，因此該模型的動力學參數，如甲烷生成潛力（B0）和最大甲烷生成速率（Rm）可用于比較分析EG和CG的甲烷生成潛力和速率。如表S4（SM）所述，EG中的Rm和B0值分別為31.8±0.9和279.3±2.0 mL CH4/g VS，是CG中相應值（分別為12.5±0.3和124.0±1.2 mL CH4/gVS）的兩倍以上，表明pI預處理不僅顯著提高了產甲烷潛力，而且提高了產甲烷量。 圖2顯示了產甲烷發酵過程中EG和CG沼氣中甲烷比例的變化。EG沼氣中甲烷的比例始終高于CG，表明在產甲烷發酵過程中，EG中更多的碳被轉變為甲烷。這一結果表明，在產甲烷發酵過程中，pI預處理可能會改變微生物群落結構。如圖2所示，盡管來自EG和CG的沼氣中甲烷的比例都表現出最初增加然后穩定的趨勢，但相應的值以不同的速率和程度增加。例如，在8天內，EG沼氣中的甲烷比例從0快速增加到73.1±2.5%，而在16天之后，CG沼氣中的甲烷比例從0緩慢增加到62.4±3.0%。換言之，pI預處理減少了WAS產甲烷發酵過程中沼氣中甲烷含量穩定所需的時間，可能是通過顯著提高甲烷產率實現的（圖1和表S4，SM）。更重要的是，一旦穩定，CG沼氣中甲烷的比例從61.8±2.0%到65.4±2.0%不等，平均值為63.4±1.3%，這與之前報道的結果一致。但EG產甲烷沼氣中甲烷的比例較高，為69.3±2.5%～76.8±2.0%，平均為74.1±2.3%，說明pI預處理提高了沼氣中甲烷的比例。對這一現象的一個合理解釋是，pI預處理提高了氫營養型產甲烷菌的活性，促進了CO2向CH4的代謝還原，從而增加了沼氣中甲烷的比例。
圖2 產甲烷發酵過程中實驗組（EG）和對照組（CG）沼氣中甲烷比例的變化。誤差線為SD。 產甲烷發酵過程中污泥有機質產生甲烷通常取決于兩個關鍵因素：（1）污泥有機質；（2）功能微生物。在產甲烷發酵系統中，這兩個關鍵元素并非獨自變化，而常通過電子轉移在污泥的固液界面上相互關聯。由以上結果，即pI預處理可顯著提高產甲烷潛力、提高產甲烷率、提高產甲烷量、提高沼氣中甲烷比例，我們假設pI預處理通過部分去除多價金屬，增強污泥中自驅動的固液界面非共價相互作用，從而促進污泥中的電子轉移，使產甲烷菌的相對豐度增加，從而增強了WAS中的NCMP。 為驗證上述假設，研究了pI預處理對污泥產甲烷轉化過程中固液界面非共價相互作用能和電子傳遞的影響。 非共價相互作用（例如范德華、靜電、氫鍵和疏水相互作用）在酶反應（例如產甲烷發酵）中尤其重要，尤其是在形成酶-底物二元復合物時。基于擴展的DLVO理論，污泥的典型固液界面非共價相互作用能主要由LW相互作用能（ 
）、AB相互作用能（ 
）和EL相互作用能（ 
）組成。 其中，非極性LW相互作用通常用來描述波動偶極誘導偶極的吸引相互作用，極性AB相互作用與疏水相互作用和水化壓力密切相關，包括氫鍵驅動疏水吸引（ 
）和水化驅動的親水排斥（ 
），而EL相互作用與極性液體中的顆粒分散或粘附直接相關。 此外，IFE是和的總和，通常用于表征界面的親水性或疏水性。 圖3使用箱線圖描述產甲烷發酵期間EG和CG的、和值變化的統計分析結果。產甲烷發酵過程中EG和CG的界面LW、AB和EL相互作用能的變化分別如圖S3、S4和S5所示（SM）。圖S6和圖S7分別展示了相同過程中EG和CG的IFE變化和估算的離子強度值（SM），并通過圖S8（SM）中的箱線圖總結了相應DF值變化。如圖3所示，在污泥中的三種界面相互作用能中，在產甲烷發酵過程中絕對值最大，并且在EG和CG中變化最大，表明疏水相互作用和水合壓力主導了固液界面的非共價相互作用污泥的分解。值得注意的是，EG中的和的波動程度大于CG中的和，表明EG中的疏水作用和水化壓力以及范德華吸引作用都強于CG。這一發現表明，pI預處理通過引起氫鍵的波動和發酵過程中偶極誘導的偶極力，增強了污泥的自驅動固液界面非共價相互作用。對上述觀察結果的一個合理解釋是，pI預處理去除了大量多價金屬，尤其是OBM（表S1，SM）。失去多價金屬的影響，有機分子的原子周圍電子云的密度增加，電子分布更容易波動，因此，由于電子密度的波動，偶極矩被讀取并不斷地移動，導致不同有機分子原子間偶極誘導偶極相互作用強度的大幅波動，并導致EG中污泥固液界面的值發生較大變化，因為有機分子的電子分布在沒有多價金屬的情況下更容易波動，所以水分子必須頻繁地在質子供體和受體之間切換，以與有機分子相互作用，這將導致氫鍵相互作用強度的快速波動，并進一步導致EG中污泥固液界面上的值的大幅度變化。據報道，偶極子誘導的偶極子相互作用有助于確定酶與底物之間相互作用的特異性活性位點和底物，以及氫鍵相互作用可以提供酶-底物二元復合物的結合能。因此，在產甲烷發酵過程中，pI預處理通過促進偶極子誘導的偶極子和氫鍵相互作用來增強污泥的界面酶促反應是合理的。這也可能解釋了為什么在產甲烷發酵過程中，pI預處理提高了甲烷的生產潛力和產率（圖1）。
圖3 實驗組（EG）和對照組（CG）污泥樣品在發酵過程中界面范德華（LW，）、Lewis酸堿（AB，）和靜電（EL，）相互作用能變化的箱線圖（對于EG，EG-LW，EG-AB和EG-EL代表，和；對于CG，CG-LW、CG-AB和CG-EL分別表示、和）。紅色和黑色實線分別表示平均值和中值；黑色實點表示異常值；須表示最大值和最小值；每個箱子包含16個測量值及95%置信區間。采用基于Storey’sfalse discovery ratecorrection的雙尾Student's T test進行多重比較分析。P<0.05被認為是顯著的（***P<0.001）。 仔細檢查圖3中值的變化，發現EG中污泥樣品的大多數值為負值，發酵期間的平均值約為−4.08 mJ/m2；相反，CG中污泥樣品的大多數值為正值，平均值為2.67 mJ/m2。這些結果表明，產甲烷發酵過程中，污泥表面的親水性和疏水性在EG和CG中都發生了變化，EG中通常為疏水性，CG中通常為親水性，說明pI預處理改變了污泥固液界面非共價相互作用的主要形式，由親水排斥改為疏水牽引。可以得出結論，pI預處理通過在產甲烷發酵過程中引入氫鍵來增強污泥的固液界面疏水相互作用，這也與測量的IFE值一致（圖S6，SM）。界面疏水相互作用通常可以提供酶促反應的驅動力，這表明pI預處理可以提高污泥有機物在固液界面的產甲烷發酵潛力。疏水相互作用是許多生物分子系統中不可或缺的組織力，并負責細胞膜和細胞內隔間的組裝。因此，可以推斷，在產甲烷發酵過程中，pI預處理還可以通過增強污泥固液界面的疏水相互作用來改變微生物代謝途徑，這一點也被來自EG的沼氣中甲烷比例明顯增加所證實（圖2）。另一個有趣的現象如圖3所示，在產甲烷發酵過程中，在最小平衡距離（≈0.157nm）處，EG中的大多數值遠高于CG中的值。例如，EG中的平均值為6.64±1.41 mJ/m2，是CG中（3.10±1.84 mJ/m2）的兩倍多。這一結果表明，pI預處理顯著增強了最小平衡距離處污泥顆粒之間的EL相互作用，導致傳質和污泥分散增加（圖S8，SM），這有利于酶（即蛋白質）等生物重要溶質的流動性，增加了溶質和污泥顆粒之間的接觸。 污泥的ETC和σ是評價產甲烷發酵過程中電子轉移潛力和ETR的兩個重要參數。一般來說，污泥的ETC值越高，電子轉移電位越大，污泥的σ值越高通常表明ETR越大。CV曲線的還原峰電位（Ep-red）可以用來表征接受電子的能壘。在這里，較小的絕對E p-red值有利于還原反應，這取決于接受電子。圖4通過箱線圖描述了產甲烷發酵過程中， EG和CG的電子傳遞（ETC、EAC、EDC和σ）和Ep-red值的變化。這些參數變化的原始數據分別展示于圖S9、S10和S11中。ETC值和IFE值之間的關系如圖S12（SM）所示。如圖4所示，EG組的平均ETC、EAC和EDC值高于CG組。例如，EG中的平均ETC值為11.10±1.65 mmol e−/g VS，高于CG中的平均ETC值（9.14±1.55 mmol e−/gVS），表明pI預處理提高了產甲烷發酵過程中污泥的電子轉移電位。對于這一發現，可以考慮兩種可能的解釋。首先，pI預處理可以部分去除有機-金屬絡合物中的多價金屬，從而增加了有機分子周圍自由電子對的數目，從而提高了電子轉移電位。這一解釋與增加的LW相互作用能（圖3）一致，它對應于由電子云漲落引起的偶極誘導偶極相互作用。其次，pI預處理增強了污泥表面的疏水性，形成了一個相對低密度的水區域，在疏水表面附近有一個開放的氫鍵網絡。因此，自由電子對通過氫鍵的運動較少受到缺乏水分子的限制，從而導致電子轉移電勢增加。這一解釋與圖S12（SM）中ETC和IFE值之間的顯著負相關（R=0.6114，P<0.01）一致，表明ETC隨著污泥固液界面疏水性的增加而增加。這一結果也可以由先前的發現證實，即水分子可以對電子轉移施加很大的障礙。如圖4（a）所示，EG的平均σ值高于CG（3.9±0.6 mS/cm 和3.4±0.5 mS/cm），表明pI預處理通過產甲烷發酵提高了污泥的ETR，這可以用Marcus理論解釋。這一理論表明多價金屬能提高蛋白質生物電子轉移的重組能，從而降低ETR。當多價金屬被pI預處理部分去除時，重組能降低，ETR增大。基于以上結果，我們認為pI預處理提高了產甲烷發酵過程中污泥的電子轉移效率（包括電子轉移電位和ETR）。
圖4 產甲烷發酵過程中實驗組（EG）和對照組（CG）污泥樣品的電子傳遞能力（ETC）、電子接受能力（EAC）和電子供給能力（EDC）變化的箱線圖。（a）EG和CG電導率（σ）的變化；（b）EG和CG還原峰電位的變化。紅色和黑色實線分別表示平均值和中值；黑色實點表示異常值；須表示最大值和最小值；每個箱子包含16個測量值及95%置信區間。采用基于Storey’s false discovery rate correction的雙尾Student's T test進行多重比較分析。P<0.05被認為是顯著的（*P<0.05；**P<0.01）。 有趣的是，從圖4中可以發現，盡管EG的平均ETC和EAC值高于CG，但EG中這些值的波動較小。因此，pI預處理后，污泥的電子轉移電位不僅增加，在整個產甲烷發酵過程中也更加穩定和可持續。圖4（b）中的另一個有趣現象是，EG中污泥的平均絕對Ep-red值低于CG中，污泥的還原反應（即接受電子）在EG中更容易發生。這進一步支持了pI預處理的污泥有機材料在產甲烷發酵過程中接受電子的能力更強（圖4中的EAC）。這也說明pI預處理后的污泥或有機物在產甲烷發酵過程中更容易接受電子。基于此，通過pI預處理可以提高微生物代謝對電子的利用效率。 為了進一步了解pI預處理是如何通過增強污泥的自驅動固液界面疏水作用和促進污泥的電子傳遞來提高WAS的NCMP，研究了IFE和ETC值與甲烷日產量的關系。 圖5（a）和圖5（b）分別描述了IFE和ETC值與甲烷日產量的相關性。表S5和表S6分別總結了相應的主要參數（SM）。如圖5（a）所示，當IFE從6.5±1.5 mJ/m2變為−28.6±1.0 mJ/m2時，甲烷的日產量呈上升趨勢，表明在產甲烷發酵過程中，隨著污泥表面由親水性變為疏水性，甲烷的日產量增加。隨后，通過相關分析證實了污泥表面的親水性/疏水性與產甲烷發酵過程中的甲烷產量之間的潛在相關性。圖5（a）顯示了IFE值與每日甲烷產量數據之間的顯著負相關（R>0.86，P<0.01），表明在污泥產甲烷發酵期間，高度疏水的污泥表面將提高每日甲烷產量。對這一觀察結果的一種邏輯解釋是，由于結構吸引力（即氫鍵驅動力和范德華吸引力），疏水性更強的污泥表面通常具有更強的疏水吸引力，驅動酶分子與底物接觸，形成酶-底物二元復合物。更疏水的污泥表面使疏水吸引力更強，酶與底物絡合的驅動力更強，從而增加甲烷的日產量。圖5（b）顯示了ETC值與甲烷日產量之間呈顯著正相關（R>0.77，P<0.01），表明在污泥產甲烷發酵期間，高電子轉移電位有利于每日甲烷產量。可以推測，污泥較高的電子轉移電勢有助于電子的利用，尤其有助于將CO2還原為CH4，從而促進污泥產甲烷發酵期間甲烷日產量的增加。此外，我們確定改善的ETC主要是由于污泥表面疏水性的增加（圖S12，SM）。因此，pI預處理可以增強污泥的固液界面疏水性，提高污泥表面的疏水性，從而提高污泥的電子轉移電位，增加甲烷的日產量。由于甲烷的生成與微生物在產甲烷轉化中的作用密不可分，因此可以推斷，pI預處理還通過增強固液界面疏水相互作用和提高污泥的電子轉移電位來改變微生物群落結構。
圖5 產甲烷發酵過程中，界面自由能（IFE）值和電子轉移能力（ETC）值與甲烷日產量之間的線性相關：（a）IFE值與甲烷日產量之間的負線性相關關系；（b）ETC值與甲烷日產量數據之間的正線性相關關系。誤差線表示SD。 為了揭示pI預處理對甲烷發酵過程中EG和CG微生物群落結構的影響，研究了EG和CG的微生物多樣性和微生物群落組成。 Shannon和Simpson指數是衡量微生物α多樣性（即物種均勻度和物種豐富度）的重要指標。Shannon指數越大，物種均勻度越高；Simpson指數越小，物種豐富度越高，物種均勻度越低。一般來說，物種均勻度水平與微生物多樣性成正比。產甲烷發酵過程中EG和CG中細菌和古菌OTU水平的Shannon和Simpson指數變化的統計分析如圖6所示。在產甲烷發酵過程中，對EG和CG在不同水平（即門、綱和屬）的細菌和古細菌群落組成之間的差異進行統計分析的結果如圖7和8所示。產甲烷發酵過程中EG和CG在門、類和屬水平上的主要細菌和古細菌群落變化的原始數據分別如圖S13和S14所示。圖S15（SM）總結了主要氫營養型產甲烷菌（即Methanobac-terium屬）和主要產甲基營養產甲烷菌（即Methanomassiliicoccales和 Methanofastidiosum)屬）相對豐度變化的統計分析。如圖6（a）所示，EG中細菌OTU水平的Shannon指數和Simpson指數的平均值略低于CG，表明pI預處理導致污泥產甲烷發酵過程中細菌物種均勻度略有下降，物種豐富度略有增加。換言之，pI預處理略微降低了細菌多樣性，這也通過分析細菌群落中的相對豐度得到了證實（圖S13，SM）。圖6（b）顯示古細菌OTU水平的平均Shannon指數在EG中高于CG，表明pI預處理改善了古細菌物種的均勻性。EG的平均Simpson指數值低于CG，表明在污泥產甲烷發酵過程中，pI預處理后，古細菌物種均勻度增加，物種豐富度降低，即古細菌多樣性增加。結果表明，在WAS產甲烷發酵過程中，pI預處理后細菌多樣性降低，古細菌多樣性增加。
圖6 產甲烷發酵過程中，實驗組（EG）和對照組（CG）微生物在OTU水平的Shannon指數和Simpson指數變化箱線圖：（a）細菌；（b）古細菌。紅色和黑色實線分別表示平均值和中值；黑色實點表示異常值；須表示最大值和最小值；每個箱子包含10個測量值及95%置信區間。 通過鑒定細菌群落組成（圖S13，SM）和分析EG和CG之間鑒定的細菌群落組成的統計顯著性差異（圖7），揭示了pI預處理對細菌群落組成的影響。如圖7（a）和S13（a）（SM）所示，在發酵產甲烷過程中，與復雜有機物降解（通過水解和酸化）有關的細菌門如Proteobacteria、Chloroflexi、Firmicutes和Actinobacteriota等，在 EG和CG中富集。然而，有趣的是，圖7（a）揭示了這些細菌門的平均相對豐度（百分比）在EG和CG之間存在差異。產甲烷發酵過程中，EG組的平均Firmicutes比例（16.9±2.9%）顯著高于CG組（11.7±5.9%），說明pI預處理顯著增加了該門的相對豐度。據報道，Firmicutes在有機物的水解和酸化中具有重要的功能。因此，pI預處理可以通過增加產甲烷發酵過程中Firmicutes的相對豐度來消除污泥有機物水解的限速步驟。這一現象也可以解釋pI預處理的甲烷生成動力學（圖1）。根據圖7（b）和S13（b）（SM），EG和CG的綱水平細菌群落主要由Anaerolineae（Chloroflexi）、Clostridia（Firmicutes）、Synergistia（Firmicutes）、Gammaproteobacteria（Proteobacteria）、Alphaproteobacteria（Proteobacteria）和Bacteroidia（Bacteroidetes）組成。由圖7（b）注意到的一個問題是，EG中Clostridia（P<0.05）、Thermoleophilia（P<0.01）和Chloroflexia（P<0.05）的平均比例顯著高于CG，表明pI預處理顯著增加了這些類別的相對豐度。在產甲烷發酵過程中，Clostridia在EG和CG中的平均比例最大。據報道，Clostridia在WAS的厭氧水解過程中起著重要作用，這進一步表明pI預處理顯著改善了產甲烷發酵過程中污泥有機物的水解。
圖7 產甲烷發酵過程中，實驗組（EG）和對照組（CG）在不同水平上的細菌群落存在顯著差異：（a）門水平；（b）綱水平；（c）屬水平。采用基于Storey’s false discovery rate correction的雙尾Student's T test進行多重比較分析。P<0.05被認為是顯著的（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001）。 此外，圖7（c）和圖S13（c）（SM）表明，除未知屬的細菌外（即“others”），產甲烷發酵過程中EG和CG中相對豐度最高的細菌屬是Thermovirga，其次是norank_f_norank_o_Aminicenantales和Romboutsia。值得注意的是，如圖7（c）所示，EG中Romboutsia（P<0.01）、nonrank_f_JG30-KF-CM45（P<0.01）、Clostridium_sensus_stricto_1（P<0.05）和Rhodoplanes（P<0.0001）的平均占比顯著高于CG，表明pI預處理對這些屬的豐度有顯著的有益作用。在產甲烷發酵過程中，Romboutsia所占的平均比例最大。據報道，Romboutsia利用葡萄糖和果糖作為生產乙酸、異丁酸和異戊酸等的唯一碳源。因此，pI預處理通過顯著提高產甲烷菌的相對豐度促進了污泥有機質的酸化（P<0.01）。有趣的是，圖7（c）表明，盡管Rhodoplanes的平均比例較低（<2%），但其豐度在EG和CG之間差異最大（P<0.0001）。Rhodoplanes是一種光合細菌，在厭氧環境中具有反硝化功能。因此，pI預處理可以支持在這樣的環境中利用光合細菌進行反硝化。總的來說，pI預處理似乎改善了WAS產甲烷發酵過程中支持水解和酸化的功能菌群。 圖S14（SM）展示了pI預處理對EG和CG古菌群落組成的影響，并且各組間差異的統計評估如圖8所示。因此，在產甲烷發酵過程中，Halobacterota、Euryarchaeota 和Thermoplasmatota均被確定為EG和CG中的優勢古菌門。圖8（a）表明，EG中的Euryarchaeota和Thermoplasmatota的平均比例高于CG（分別為43.2±12.0%和37.1±12.6%和3.1±2.1%與2.2±1.4%），表明pI預處理可改善產甲烷發酵過程中這些門的相對豐度。一般而言，除Methanosphaerastadtmaniae（H2依賴型甲基營養微生物）物種外，已識別的Euryarchaeota產甲烷菌大多是hydrogenotrophs。此外，所有已鑒定的Thermoplasmatota產甲烷菌均為H2依賴型產甲烷菌。因此，pI預處理可改善氫營養型產甲烷菌和H2依賴型甲級營養產甲烷菌的相對豐度，并增強代謝反應4H2+CO2→CH4+2H2O，從而導致WAS產甲烷發酵過程中產生的沼氣中甲烷的比例較高（圖2）。 在綱水平，如圖8（b）和S14（b）（SM）所示，Methanosarcinia, Methanobacteria 和Thermococci被確定為EG和CG中的主要古菌綱，并且各組之間的平均相對豐度不同。例如，EG的平均相對豐度為32.7±6.9%，比CG高24.8%。如圖所示8（c）和14（c）所示，產甲烷發酵過程中EG和CG中的古菌群落主要為Methanosaeta, Methanobacterium, Candidatus_Methanofastidiosumand Methanosarcina。然而，這些古菌群落的相對豐度在EG和CG之間存在差異（分別為38.7±13.5%、30.0±6.3%、10.6±8.0%和9.3±4.1%以及 42.5±11.7%、23.1±6.8%、10.9±8.7%和10.9±5.0%）。Methanosaeta 和Methanosarcina是典型的乙酰營養型產甲烷菌，Methanobacterium是典型的氫營養型產甲烷菌，Can- didatus_Methanofastidiosum是H2依賴型甲基營養產甲烷菌。因此，在屬水平上，主要乙酰營養型產甲烷菌的平均相對豐度（即Methanosaeta 和Methanosarcina）的平均相對豐度在EG中約為48%，在CG中約為53.4%，這一差異表明pI預處理抑制了乙酸分解為CH4的代謝途徑。或許，pI預處理增加了古菌多樣性（圖6（b））并提高了其他產甲烷菌的相對豐度（圖S14和圖S15，SM）。這也與EG和CG在屬水平上主要氫營養型產甲烷菌（即甲烷）的平均相對豐度出現的差異一致。pI預處理后，主要氫營養型產甲烷菌的相對豐度增加了29.9%，表明污泥產甲烷發酵過程中CO2向CH4的還原作用增強。此外，圖8（b）和（c）中的統計結果表明，EG中的Methanobacteria（Euryarchaeota，P<0.05）和Methanobacterium（Methanobacteria，P<0.05）的平均比例顯著高于CG，說明pI預處理對WAS產甲烷發酵過程中這些類群有顯著的促進作用，進一步證實了pI預處理顯著提高了WAS產甲烷發酵過程中氫營養型產甲烷菌的相對豐度。
圖8 產甲烷發酵過程中，實驗組（EG）和對照組（CG）的古菌群落在不同水平上存在顯著差異：（a）門水平；（b）類群水平；（c）屬水平。采用基于Storey’s false discovery rate correction的雙尾Student's T test進行多重比較分析。P<0.05被認為是顯著的（* P<0.05）。 為了進一步了解pI預處理通過增強自驅動固液界面疏水相互作用，促進污泥中電子轉移改變產甲烷菌群落結構，探討了IFE和ETC與產甲烷菌主要屬相對豐度的關系。 圖9和圖10中分析了IFE和ETC與乙酰營養型產甲烷菌（Methanosaeta和Methanosarcina）和氫營養型產甲烷菌（(Methanobacterium）相對豐度的相關性。表S7-S10（SM）總結了相應的主要參數。如圖9所示，隨著IFE從正值變為負值，乙酰營養型和氫營養型產甲烷菌的相對豐度呈現出增加的趨勢，表明污泥表面的疏水化增加了這兩種生物的相對豐度。因此，疏水污泥表面有利于產甲烷菌屬的富集。相關分析證實了這一可能性，結果表明，圖9（a）中主要的乙酰營養產甲烷菌的IFE值與主要的產甲烷菌的相對豐度之間分別存在顯著的負相關（R>0.74、P<0.01和R>0.64，P<0.01）。因此，可以得出結論：產甲烷發酵過程中，主要的乙酰營養型和氫營養型產甲烷菌傾向于優先聚集在疏水污泥表面，這也可以解釋為什么高度疏水的污泥表面促進產甲烷發酵期間的甲烷日產量（圖5）。對于這種發現，一個邏輯解釋是疏水表面通常對微生物具有很強的疏水吸引力（即吸引結構力）（圖3），這有利于微生物粘附。相反，親水表面通常具有強親水排斥（圖3），這有利于微生物分散。在營養濃度較低的水生環境中，例如產甲烷發酵過程中的污泥，表面附著微生物通常比游離細胞更具化學活性。因此，在WAS產甲烷發酵過程中，疏水污泥表面含有相對較大的主要活性乙酰營養型和氫營養型產甲烷菌種群。
圖9 產甲烷發酵過程中主要產甲烷菌屬的相對豐度與界面自由能（IFE）值呈負線性相關：（a）乙酰營養型產甲烷菌；（b）氫營養型產甲烷菌。誤差線表示SD。
圖10 產甲烷菌轉化過程中電子轉移能力（ETC）值與主要產甲烷菌屬相對豐度的線性關系：（a）乙酰營養型產甲烷菌；（b）氫營養型產甲烷菌。誤差條表示SD。 圖10示出，隨著ETC值的增加，主要的乙酰營養和氫化產甲烷菌的相對豐度分別降低和增加，表明污泥的電子轉移電位可能與兩種產甲烷菌的種群有關。相關分析證實了這種可能性如圖10（a）所示，ETC值與主要產乙酰營養型產甲烷菌的相對豐度呈顯著負相關（R>0.69，P<0.01），而ETC值與主要氫營養型產甲烷菌的相對豐度呈顯著正相關（R>0.77，P<0.01）（圖10（b））。電子轉移電位的提高似乎有利于主要氫營養型產甲烷菌的富集，但不利于主要乙酰營養型產甲烷菌的富集。在氫營養型產甲烷菌所使用的代謝途徑中，CO2還原為CH4可能嚴重依賴于電子，因此高電子轉移電位有利于CO2的還原。相反，在乙酰營養型產甲烷菌所使用的代謝途徑中，甲基作為一個單元從乙酸轉移到CH4，并且每個CH4分子的一個H原子來自溶劑（即H2O）。因此，乙酰營養型產甲烷菌將醋酸鹽分解成CH4和CO2的過程可能不太依賴于電子供應。因此，在整個產甲烷發酵過程中，較高的電子轉移電位有助于氫營養型產甲烷菌的富集，使其比主要的乙酰營養型產甲烷菌更具優勢。這一結果還表明，pI預處理可以通過提高污泥的電子轉移電位來提高氫營養型產甲烷菌的相對豐度。 然而，我們注意到，微生物表面熱力學是連接微觀尺度生物結構和宏觀尺度生物功能的典型橋梁。由于WAS主要由微生物組成，因此其固液界面熱力學將架起污泥微觀結構與產甲烷發酵等宏觀生物功能之間的橋梁。pI預處理通過部分去除多價金屬來破壞污泥結構，顯著改變污泥的固液界面熱力學，從而影響宏觀生物功能，導致微生物多樣性的變化。具體而言，pI預處理顯著提高了污泥的自驅動固液界面疏水相互作用（圖3）和電子轉移效率（圖4），從而增加了主要乙酰營養型和氫營養型產甲烷菌的相對豐度（圖5）。電子轉移電位對氫營養型產甲烷菌的促進作用比對乙酰營養型產甲烷菌的促進作用更強，這導致前者的相對豐度更大的增強和產甲烷菌群落結構的變化（圖6和8）。 在本研究中，我們證實了pI預處理可以增強污泥的自驅動固液界面非共價相互作用，提高污泥的電子傳遞效率，從而增強驅動酶間反應的非生物力，提高污泥中功能微生物的相對豐度水解、酸化和甲烷化。這些變化提高了WAS中甲烷的生成效率。主要結論如下： （1） pI預處理提高了WAS產甲烷潛力、產甲烷速率和沼氣中甲烷的比例。例如，pI預處理后，最大產甲烷潛力和產甲烷率分別提高了122.2%和154.4%，沼氣中甲烷的最大比例達到76.8%。 （2） pI預處理增強了污泥自驅動的固液界面疏水相互作用，通過增強產甲烷發酵過程中的疏水吸引力，增強了污泥界面酶促反應的驅動力。 （3）pI預處理通過正向移動產甲烷發酵過程中的還原峰電位，提高了污泥的電子轉移效率并減少了還原反應的障礙。 （4） pI預處理提高了水解、酸化和甲烷化主要功能微生物的相對豐度，尤其是氫營養型產甲烷菌（+29.9%）。 （5）污泥產甲烷發酵能力與固液界面非共價相互作用之間存在著密切的內在聯系。污泥表面具有較強的疏水吸引力和較高的ETC能提高甲烷的生成效率。 這些發現將為開發第二代預處理方法提供參考，其目的是通過去除污泥中固有的抑制物質和增加驅動污泥中表面酶反應的非生物力來提高污泥的生物降解性，而不是僅僅關注初始有機物污泥溶解。此外，這些發現還為通過監測界面熱力學、電化學特性和微生物群落的變化，為揭示厭氧發酵這一“黑箱”過程提供了理論技術參考。
